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【共享】结晶牛胰岛素成功合成始末(上)

2019-10-23 22:43  作者:admin 点击:次 

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  人工全合成结晶牛胰岛素的成功获得,是我国科学家取得的一项载入史册的伟大成就,至今让国人引以为豪。不过,这项研究课题的提出,最初是在“”时期作为一颗“科学卫星”被放出来的。

  由此,在对这项成就的历史回顾中,特别需要我们深思的是:上世纪五六十年代,在严重落后的科研条件、极为艰难的国内外环境中,我国科学家如何能够取得如此重大的科学突破?

  中科院自然科学史所副研究员熊卫民,经过多年细致入微地调查研究,详细记述了在多起政治运动的冲击下,我国科研人员完成这项科研工作的曲折、艰辛的过程,以及它获得诺贝尔化学奖提名的经过。其间的故事可谓跌宕起伏,波澜壮阔。

  为让读者对这段历史有更为清晰的了解,《赛先生》获作者授权刊发此文,限于篇幅,我们将分三次陆续与读者分享。

  1965年9月17日,在历经6年9个月的艰辛之后,中国科学院生物化学研究所、有机化学研究所和北京大学化学系的科学家成功获得人工合成的牛胰岛素结晶。这是一项伟大的胜利,不仅开创了人工合成蛋白质的新纪元,对中国随后的人工合成酵母丙氨酸转移核糖核酸等生物大分子研究起了积极的推动作用,还证明中国可在尖端科研领域与西方发达国家一决高下,极大地增强了民族自豪感。

  这项课题是在“”运动中提出的。1958年5月,中国八届二中全会提出“鼓足干劲,力争上游,多快好省地建设社会主义”的总路线,“”运动全面铺开。它不仅冲击了农业和工业生产,还对科研工作产生了巨大影响。科技人员也开始大放“科学卫星”,并把课题的完成时间一再提前。1958年5月14日、16日,在中国科学院地学部、生物学部联合召开的京区各所跃进大会上,通过相互挑战和打擂台等方式,中国科学院京区一些研究机构的科技人员提出了诸如“人造小太阳”“融化高山的冰雪灌溉荒漠”“在三年内消灭稻虫”“在一年至三年内解决小麦锈病、稻瘟病等十多种农作物严重病害”之类气魄宏伟的畅想。

  不久,在中国科学院上海办事处的鼓动下,中国科学院沪区一些研究机构的科技人员也提出了一些宏大的课题。如实验生物所决心集中力量攻克肿瘤;有机所表示要研究活性染料、氟化学;生理所提出要搞针灸、经络和生物上天;植物生理所提出要搞“稻草变油”;而药物所则喊出了“让高血压低头、肿瘤让路、血吸虫断子绝孙”的响亮口号。

  在各兄弟单位竞先放出了多颗“科学卫星”之后,中国科学院生物化学研究所该提出什么样的语惊四座的课题呢?这是摆在该所每一位科技人员面前的问题。1958年6月,在一个有王应睐、邹承鲁、曹天钦、沈昭文、钮经义、王德宝、周光宇、张友端、徐京华等9人参加的高研组讨论会上,他们争先恐后地提出了一个一个的课题,然后那些题目往往又因为气魄不够“跃进”等原因而一个一个被否定掉。突然,不知是谁(注1)喊出了这么一句话:“合成一个蛋白质!”七嘴八舌的声音一下子停了下来。这个目标确实够宏大!伟大革命导师恩格斯曾经说过:“生命是蛋白体的存在方式”,“如果某一时候化学能够人工地制造蛋白体,那么这蛋白体也必然会呈现出生命的现象,即使是最微弱的生命现象”(注2)。如果能够完成这个伟大设想,让人工合成的第一个有生命活力的东西在中国诞生,那将是何等巨大的辉煌啊!就这样,他们把这颗“卫星”保留了下来。

  因为没把握,在那次会议上,他们只是简单地提了提要用化学方法合成一个蛋白质,至于完成的时间则被设定为20年之内。然后,它被摆到群众讨论会上。其他的年轻人也一下子就被它吸引住了。他们更加“敢想敢干”,而且“人多热气高干劲大”,在“一天等于二十年”的激动人心的年代,怎么能容忍一个题目要做20年?完成时间立即被缩减为5年。

  会后,大家还马上查起了文献。资料表明,这个设想是有一定科学基础的:其一,1953年时,维格纳奥德(V. du Vigneaud)完成了世界上首例有生物活性的多肽——催产素的合成,给人们提供了一套可行的多肽合成方法。运用这套办法,1958年时,人们成功合成了具有促黑激素活力的一段十三肽;其二,1955年,桑格(F.Sanger)完成了第一种蛋白质——胰岛素——的一级结构测定工作,使它成为一种可能的合成对象。不过,面临的困难也非常大。毕竟蛋白质比多肽要高级,即使根据正确的一级结构合成了胰岛素的正确多肽链,能否将它们“折叠”到正确的三维结构,从而让它们变成有生物活性的蛋白质,还不得而知。而且,生化所,乃至全中国都还没有人从事过多肽合成工作,这方面的工作具体有多难,谁也不知道。甚至,中国连与合成蛋白质相关的原料也基本没有。蛋白质由氨基酸构成,可当时国内(大陆地区)只能生产纯度不高的甘、精、谷三种氨基酸,合成胰岛素需要的另外十几种氨基酸都得从香港转口进来,不但价格昂贵,而且远水解不了近渴。

  虽然课题尚未完全定下来,但作为“成果”,它还是被放到“上海市科学技术展览会”上去参加展览。负责画展板的徐罗马先生不是研究人员,不大懂相关知识。要展览合成蛋白质,他理解成了合成生命,就夸张地画了一个站在三角瓶里的小娃娃。更有戏剧性的是,1958年7月中旬,这幅漫画还吸引了前来参观的周恩来总理的注意。他在这幅画前停了下来,问讲解人员这项工作啥时能完成。讲解人员赶紧回答,生化所打算用5年的时间。“5年是不是太长了?”周恩来将了生化所一军。看到周恩来这个态度,同行的李富春、柯庆施也表示要鼓励、支持这项工作。而生化所则“经过热烈的讨论”,赶紧把完成的时间“减为4年”。

  这个事情看上去很偶然,其实也不尽然。众所周知,1957年苏联卫星上天以后,东西方冷战以高技术领域竞争为主要形式,所有大国的科学与技术无不服从于“弘扬国威”的最高政治需求。中国当时正秘密研制***和**,如果在基础研究中拿出重要研究成果,也正与国家战略目标相一致。而周恩来是比较重视基础研究的。在他的关心下,1956年制订的《一九五六至一九六七年科学技术发展远景规划》中特意增设了一类“科学研究重点”:“自然科学中若干基本理论问题”。其中,就包括“蛋白质的结构、功能和合成的研究”(注3)。

  不管怎么样,得到中央领导人关注之后,“合成一个蛋白质”就不再只是一个不经意的科学畅想或口号了,它很快就被列入全国1959年科研计划(草案),成为国家意志的一种体现。而国家下达的战略性研究计划,必须由科研人员落到实处。1958年9月,蛋白质专家钮经义受命率领黄维德、陈常庆、许根俊、王尔文等人,以合成催产素的方式练兵,体验一下多肽合成、分析、鉴定等工作的实践和难度。幸运的是,当年10月他们就获得了具有生物活性的催产素粗制品。不久,北京大学生物系也开展了这方面的工作,并于当年12月17日获得成功(注4)。

  初步掌握多肽合成的技术后,合成蛋白质工作进一步提上了日程。究竟合成什么蛋白质呢?当时已经确定了一级结构的蛋白质只有胰岛素一种,没有别的选择。通过生化所全所人员的查资料、大讨论,并通过邀集国内多家科研机构的知名专家一道进行胰岛素文献报告学习会,1958年12月21日,生化所最终确定了人工合成胰岛素的课题。不但如此,完成的时间“指标也一再提前,由最初的五年改为四年、三年、二年,最后大家鼓足干劲,决定把这项工作作为59年国庆十周年的献礼”。相关人员还规定了第一、二、三、四、五次“战役”的重点以及“三八”、“五一”、“七一”、“十一”等节日的献礼内容。顺便指出,这项工作后来(1959年6月)还获得了国家级机密研究计划所特有的标志:它的代号为“601”,也即“1960年第一项重点研究项目”。

  为了提供合成的原材料,生化所于1958年下半年组织了技术小组,从无到有,制作出了十几种氨基酸。并在这个技术小组的基础上,于1958年底组建了东风生化试剂厂。东风厂后来由小到大,共可生产700余种生化试剂、药物、培养基和分离分析材料,供全国科研之需。“**”前夕时,它每年可向科学院院部上交利润200~300万元,效益一度非常好。

  后排:右1,许根俊;右2,张友尚;右4,戚正武;右5,龚岳亭;右9,杜雨苍。

  1959年1月,胰岛素人工合成工作开始正式启动。生化所建立了以副所长曹天钦为组长的五人领导小组来领导胰岛素合成工作。为了达到符合要求的速度,他们决定采用“五路进军”、“智取胰岛”的方案,即:“(1)有机合成——钮经义负责;(2)天然胰岛素拆合——邹承鲁负责;(3)肽库——曹天钦负责;(4)酶激活——沈昭文负责;(5)转肽——沈昭文负责”(注5)。

  经过钮经义等人在合成催产素上的摸索——虽然只是遵照比较完善的文献重复维格纳奥德的工作,他们也已花了几个月的时间(注6)——甚至在此之前,大家就已经清楚,胰岛素的人工合成会是一个工作量极大的科研工作,而且工作量中非常大的一个部分,将是对肽链的有机合成或酶促合成。生化所既缺乏有机合成方面的经验,人手又不够,于是想找别的研究有机化学的单位合作。

  他们找了中国科学院有机化学研究所和北京大学。有机所的负责人汪猷不愿意参加这项工作,但北京大学校党委给予了积极的回应,他们安排化学系有机化学教研室、生物系生物化学教研室和生化所合作,并委派自然科学处处长、生物系教授张龙翔主管此事。1958年12月,北京大学有机及生化教研室派人赴上海参加了“(第一次)胰岛素文献报告学习讨论会”),和生化所草拟了一个分工方案。为了进一步明确分工,1959年3月9日至12日,邹承鲁和曹天钦、王芷涯、钮经义、鲁子贤等五人到了北大。在做了几场与胰岛素相关的学术报告之后,他们代表生化所和北京大学拟订了正式的合作协议。决定由北大有机教研室负责胰岛素A链的合成;生化所负责胰岛素B链合成以及A、B链的拆合;北大生化教研室参与生化所负责的部分工作;等等。北大有机教研室的相关工作由张滂教授负责——他任研究组组长,教研室主任邢其毅教授和副系主任文重也管此事。

  1959年4月6日之后,邢其毅、张滂两人各带了一批研究生和青年教师开始全面展开工作。在他们的指挥下,研究生季爱雪、周淑贤、单书香、陆得漳,青年教师徐端秋、伍少兰、陆德培及一位进修教师分成四个小组,带领有机专业的一些应届毕业生以毕业论文的方式开展合成研究。

  刚刚于1958年由生化所协助建立的复旦大学生化教研室也想参加胰岛素合成工作。大概由于该教研室缺乏化学专家,生化所不太愿意,在1958年12月拟订的初步分工上,只同意让它参与做一点天然胰岛素制备工作;在1959年3月拟订的正式协议上,则没有把复旦大学列为协作单位。

  虽然生化所没能在计划的时间完成第一次协作会议时所预定的任何一个目标,但酶学专家邹承鲁所领导的拆合小组——成员有杜雨苍、张友尚、许根俊、鲁子贤等——还是很快就发现了一个重要“苗头”:1959年3月19日,发现拆开后的胰岛素A、B链混合物在重新氧化后能表现出天然胰岛素0.7~1%的活力。

  工作一开始就困难重重,曾经用过七种方法都没能完全拆开胰岛素的三个二硫键,最后他们根据当时文献上新出现的拆开二硫键的方法,将天然胰岛素与亚硫酸钠及四硫硫酸钠共同保温,终于将胰岛素完全拆开成了A链及B链,并且所得到的S-磺酸型A链及B链非常稳定,经得起反复纯化。这是一项有意义的成果,但因为有保密要求,邹承鲁、杜雨苍等人没有立即把它发表出来。

  二硫键拆开之后,A、B两链能否重新组合成为胰岛素?据已有的知识看,如果说不是绝非可能,那么也是万分困难的。在过去的大约三十年中,不少人曾多次进行过重新组合实验,每次得到的都是否定的结果。于是胰岛素的研究者普遍认为,一旦胰岛素的二硫键被拆开,就不可能让其重新恢复生物活性。

  面对文献所给出的这种结论,邹承鲁“顾虑”多多,1958年刚从北大毕业后分配到生化所工作的杜雨苍也心怀“恐惧”。但在形势的激励下,他们并不死心。邹承鲁认为,过去的失败在于采用强氧化剂迅速氧化,太急于求成了。他们就采用较温和的做法。历经艰辛,经过多次试验,他们在1959年3月19日初步得到了一个肯定的结果——接合产物居然表现出了0.7~1%的生物活性!他们继续摸索更好的条件,以进一步巩固成果。又经过多次失败,在克服了许多技术障碍以后,终于在1959年国庆献礼前摸索出了不使用氧化剂,而使氧化反应在较温和的低温、较强碱性(最适Ph值为10.6)的水溶液中由空气缓慢完成的方法,使天然胰岛素拆开后再重合的活力稳定地恢复到原活力的5~10%。

  这是一个重大成果,不仅指导和解决了胰岛素合成的路线问题——在这之前,大家一直在想,究竟是先合成两个各通过一个胱氨酸残基结合的“工”字形肽,然后再延长、连接它们,还是先分别合成胰岛素的A、B两条链,然后再结合二硫键呢?这还在一定意义上提前试验了胰岛素合成的最后一步工作。为了吸取拆开工作未及时发表的教训,生化所于1959年11月16日向中国科学院党组上书,要求尽快发表重合成成果:“目前在胰岛素再合成问题上,我们已经抢先。若等待A、B链完全合成后,胰岛素全合成成功时,再一并发表,则很可能在再合成的发表上落后于国外”。然而,基于保密考虑,为了避免“帝国主义”的同行——那个时候,他们已经知道美国和联邦德国各有一个实验室也在进行胰岛素的人工合成工作——利用该发现而首先完成胰岛素的合成,科学院领导没有批复“同意”。一年之后,加拿大科学家迪克松(G.H.Dixon)和沃德洛(A.C.Wardlaw)在Nature杂志上发表了类似的结果(注7)。虽然他们只恢复了1~2%的活力,成绩远没有邹承鲁等人的好,但在发表时间上却抢到了我国科学家的前面。当然,国内同行还是比较早就知道了生化所的这项成果,因为杜雨苍、邹承鲁于1960年1月在“第一次全国生化学术会议”上对此成果作了报告。而且,后来国际同行也还是欣赏这项成果的,生化所拆合小组所摸索出来的这套重组方法曾被国际蛋白质技术界称为杜—邹法。由于产率较高(经过多次努力,他们最终把产率提高到30%以上),在最早用基因工程方法生产胰岛素,连接分别生产的A和B链时,所用的也是杜—邹法。

  1959年夏天,生化所还把正在漕河泾农场下放劳动的张友尚召了回来,让他分离纯化重合成胰岛素。通过反复实践,张友尚等找到了一个合适的提纯方法:先利用分子量的不同,通过柱层析和超速离心法将接了好几条链、分子量较大的产物和仅含一个A链接一个B链的产物分开;然后用酸性正丁醇溶剂将重组合胰岛素从后者中抽提了出来;再对抽提出来的纯度相当高的重组合胰岛素进行结晶。1959年底,他们得到了和天然胰岛素晶型一致的重合成胰岛素的结晶。

  由两条变性的链可以得到较高产率的、有生物活力的重合成胰岛素的结晶,这就从实践上进一步证明:“天然胰岛素结构是A、B多肽链所能形成的所有异构体中最稳定的”(注8);推广一点说,也即蛋白质的空间结构信息包含在其一级结构之中。这个结果解决了令人望而生畏的“折叠”问题——根本就不需要另加人力去做,A、B两链能够按天然结构自动折叠成胰岛素——具有非常重大的理论意义。但又是基于上述保密要求,邹承鲁、张友尚等人没能及时发表此成果。1961年5月,美国科学家安芬森(C. B. Anfinsen)在Journal of Biological Chemistry(《生物化学杂志》)上发表了一项类似的、相对而言较为简单的工作——拆开单链的核糖核酸酶的四个二硫键,发现它们可以重新连接并以很高的水平恢复酶活性。安芬森由此断言:“蛋白质的一级结构决定高级结构”(注9)。虽然邹承鲁等人的论文只比安芬森的发表得只略晚一点——于1961年8月用中文正式发表在新创刊的《生物化学与生物物理学报》上(学报于1961年2月9日收到此稿),并于同年10月用英文发表在刚刚复刊的国内唯一的西文科学期刊Scientia Sinina(《中国科学》)上——可由于《中国科学》在国际上的知名度远不如国外刊物,加以他们当时集中关心合成问题,没有对结论作进一步的推广,他们的工作的价值没有得到充分地承认,只被当成了安芬森原创性工作的一个佐证。1972年的诺贝尔化学奖只授予了安芬森,而没有让邹承鲁等人分享。

  与拆合工作的快速前进相比,合成方面的工作进展要慢得多。经过几个月的探索,尤其是拆合工作有“苗头”之后,大家决定放弃“五路进军”中的后三路,把力量集中在拆合与有机合成上。虽然已经有比较经典的方法,而且经过合成催产素的洗礼,相关科学家已经初步掌握了这些方法,有机合成仍然非常困难。没选择好合适的溶剂、保护基、缩合剂,没选择好合适的肽段大小,没选择好接头,等等,都可能使合成工作功亏一篑。这些方案都需要摸索;而且,一般说来,每接一个氨基酸都需要三四步反应,都需要极为繁复的分离纯化、分析检定工作,不但工作量大,而且一环紧扣一环,只要一步不合要求,就有可能前功尽弃。虽然困难很大,1959年底时,钮经义所领导的合成小组还是取得了不少成就:不但掌握了多肽合成各种技术,还将B链的所有30个氨基酸都联成了小肽(其中只个别二肽有文献记载),最长的已达到了8肽。北京大学化学系因为起步较迟,教学及其他任务繁重,进展慢多了。到1959年底时,主要只做了氨基酸的分离、特殊试剂的合成、分析分离方法的建立等工作,另外也合成了一些2肽。

  生化所对北大的进展有所不满,在向领导报告、要求放宽时间指标时,曾数次提到过这点。但总的说来,双方的协作关系还是不错的。除了经常派人互访外,大概每两周总结工作一次,写成简报,分送各协作单位。在准备和探索阶段,各协作单位的工作人员比较稳定,分布情况大致是:生化所23人;北京大学生化教研室26人;北京大学有机教研室25人;复旦大学生化教研室2人。

  虽然存在一些明显的弊端——譬如指标、计划定得过细、过于明确,给参加工作的科学家增添了许多不必要的限制和压力,使他们精神过于紧张,难以保持平常心态,难以发挥出最佳的创造力;保密方面要求过于严厉,只追求最终结果的完成,而忽视了更重要的中间成就的发表,结果背离了科学研究的基本精神,严重阻碍了国际同行对我国科学家所取得的成就的承认,并从而不可避免地挫伤了我国科学家的工作积极性——但在1959年间,各相关单位总的工作气氛还算是比较好的,所取得的成就也是比较重大的。

  1. 张友尚认为最早的提出者很可能是沈昭文。见:张友尚.第一个在体外合成的蛋白质——结晶胰岛素全合成的个人追忆.中国科学(生命科学).2010(1):8-10.

  4. 王学珍等.北京大学纪事(一八九八——一九九七).北京:北京大学出版社,1998. 540页.

  5. 王芷涯.中国科学院上海生物化学研究所胰岛素全合成工作情况.院史资料与研究.2000(5):62-77.

  6. 虽然他们在1958年10月即获得了具有生物活性的初产品,但一直要到1959年国庆献礼前后,才真正完成合成工作。做出来后,生化所很快把技术转让给了上海生物化学制药厂,六十年代初该厂开始生产催产素,并很快出口创汇,一个季度可得外汇24万元。这是国内第一个投入实际应用的多肽。据熊卫民. 回顾胰岛素的合成——杜雨苍研究员访谈录.中国科技史料,2002(4):323-334.

  8. 杜雨苍等.从胰岛素A及B链重合成胰岛素.生物化学与生物物理学报,1961(1):13-25.


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